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農林育種研究

2019-05-22點擊4204次
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高通量技術在農林領域的廣泛應用大大地加速了農林研究的進程,通過基因芯片及測序等技術可以幫助科研工作者解決農林領域研究中的各類問題,如:性狀相關變異篩選、群體進化與選擇、轉錄后基因調控、微生物群體結構多樣性等等。

伯豪生物可以為您提供多組學的農林研究解決方案,包括:基因組層面全基因組重測序、Affymetrix SNP芯片、Illumina SNP芯片;轉錄組層面mRNA測序、全轉錄組測序/lncRNA測序、circRNA測序、miRNA測序;微生物層面16S rDNA/18S rDNA/ITS擴增子測序、宏基因組測序(元基因組測序)等。伯豪生物用科學的項目方案設計,嚴謹的實驗數據質控,專業的生信分析團隊,豐富的項目合作經驗,為您的研究和數據帶來扎實的服務,加速您的研究。

 

農林特色服務——BSA測序定位

一、BSA定位——快速定位性狀基因

1.1 BSA方法簡介

在動植物性狀定位研究中,將家系后代中具有極端相反性狀的個體分為兩組,尋找出與性狀呈共分離的分子標記,從而實現性狀定位的方法,稱為混合分組分析法(Bulked Segregant Analysis,BSA)。BSA的思想早在1991年就由Michelmore在萵苣的抗病性性狀定位研究中提出1。在高通量測序普及的近十年內,BSA再次成為了性狀定位研究的熱點,NGM2、SHORE-Map3、QTL-seq4、MutMap5, 6等方法不斷提出,并得到了廣泛應用。

在實驗設計上,BSA測序使用了極端性狀的兩個群體進行Pool-seq,對比變異位點基因頻率的差異,找出那些具有明顯差異的位點作為性狀候選位點。根據應用的差異,BSA測序已產生了多種分析方法。QTL-seq可用于應對自然發生的數量性狀和質量性狀。MutMap是一種特定的應用,分析尋找的是EMS誘變導致的突變性狀,而非自然產生的突變。下面將詳細介紹這兩種方法。

 

 1.2 QTL-seq

QTL-seq是Hiroki(2013)提出的QTL定位方法4。與傳統QTL連鎖定位方法一樣,QTL-seq也是基于遺傳群體來進行實驗的,但它更為快速和節省成本,并可達到較高的準確性。下面是取樣設計和分析原理的示意圖(圖1.2)。

圖1.2. QTL-seq流程示意圖(Hiroki 2013)4

 

1.3 MutMap

MutMap是用于尋找EMS誘變性狀的方法。在取樣設計和分析原理上與QTL-seq十分類似,同樣是基于遺傳群體的取樣設計,在混池測序后比較基因頻率,找出SNP-index接近1的候選位點。下面是原理示意圖(圖1.4)。

圖1.4. MutMap流程示意圖(Abe 2012)6

 提出QTL-seq分析方法的Ryohei Terauchi教授研究組還針對分析中可能遇到的各種情況提出了解決方法(表1.1)。MutMap+7和MutMap-Gap8是MutMap的特殊形式,適用于突變致死、無法異交和性狀位點不在參考基因組的情況。

表1.1. MutMap的衍生應用

 

 二、技術路線

 

 

三、BSA測序實驗設計

3.1 實驗參數

QTL-seq和MutMap除了實驗材料的準備上略有不同,其它幾乎沒有區別(表2.1)。

表2.1. BSA測序實驗參數

 

3.2 注意事項

取樣策略:對于QTL-seq取樣,有時需要在極端性狀和樣本數量之間做均衡。理想情況下,取極端各5%的群體30個樣本,則需群體大小為 30/0.05 = 600個。在群體數量不足時(尤其是RILs群體),則可放寬極端性狀標準,并適當減少混池樣本數目。

誤差來源:由于使用了Pool-seq的測序策略,在估計基因頻率時很難排除由于測序錯誤導致的偏差,需要在分析中使用sliding windows的策略來降噪;樣本DNA質量不均、混樣濃度不統一將會為頻率估計帶來偏差,但這可由增加群體樣本數量來進行一定程度的彌補。

 

3.3 BSA測序應用案例

案例一 MutMap方法快速培育耐鹽水稻品系Kaijin5

在日本的Ryohei Terauchi團隊提出MutMap方法兩年后,他們成功使用該方法在兩年之內快速培育出了一個耐鹽水稻品系Kaijin并成功推廣(圖2.1.)。

圖2.1. a. SNP-index圖,藍色點為每個SNP的SNP-index數值,紅色線為以窗口(Sliding windows= 4Mb,步移10kb)為單位的SNP-index分析,橙色線為99%置信區間;b. OsRR22/HST1基因結構,綠色框為Tos17插入突變位置;c. Sanger測序驗證突變位點導致提前終止;d. Tos17插入突變驗證OsRR22的功能,不耐和耐鹽分離比為3:1。

 

研究使用了6,000株EMS誘變過的水稻品系Hitomebore,經過7天的1.5% NaCl條件培養,選擇出耐鹽突變品系hst1。經過與已有耐鹽品系比較,發現hst1具有更強的耐鹽性,適合作為優良品系育種的親本。接下來,hst1與野生型Hitomebore進行雜交并構建F2群體,經過0.75% NaCl處理,發現不耐鹽和耐鹽分離比符合3:1的關系。將耐鹽F2子代20株進行混池測序,并與野生型親本進行比較,得到1,005個突變位點。對這些突變位點進行SNP-index的計算,統計出顯著偏離0.5的點,發現2個SNP-index =1的位點,其中一個導致OsRR22基因的第三外顯子發生提前終止,另一個位于非編碼區。作者使用了水稻Tos17突變體庫的OsRR22突變株驗證了該突變結果確實將導致水稻耐鹽,并通過回交親本和Sanger測序驗證培育出耐鹽品系Kaijin。此項工作證明了MutMap方法在育種領域的高效性。

 

原文出處:Takagi H, Tamiru M, Abe A, et al. MutMap accelerates breeding of a salt-tolerant rice cultivar[J]. Nature Biotechnology, 2015, 33(5):445-9.

 

案例二 使用QTL-seq快速定位水稻的數量性狀4

研究者使用了抗稻瘟病和易感稻瘟病品系雜交構建了RILs群體,并對直鏈淀粉低含量和高含量品系、稻苗低活力和高活力品系雜交構建了F2群體。隨后,這些性狀在RILs和F2群體中出現了性狀分離,作者挑選了具有極端表型(極抗病/極易感病,極高/極低淀粉含量,以及極高/極低活力)的個體分別混為兩個DNA池并進行建庫,并進行全基因組重測序,通過群體間SNP頻率的差異來進行基因定位。結果表明,QTL-seq與傳統QTL連鎖定位方法得到的QTLs位點相符(圖2.2)。

圖2.2.在水稻RILs群體中用QTL-seq尋找抗稻瘟病位點。a. 抗稻瘟病品系Nortai和易感病品系Hitomebore在2周真菌處理后的情況;b. 對RILs不同個體抗病表型進行分級;c. 4和5級作為抗病組,8 – 10 級作為易感組進行混池;d. 綠色和黃色分別代表抗病和易感組,藍色代表兩者SNP頻率差值;底部圖為QTL連鎖分析結果。

 

原文出處:Takagi H, Abe A, Yoshida K, et al. QTL‐seq: rapid mapping of quantitative trait loci in rice by whole genome resequencing of DNA from two bulked populations [J]. Plant Journal for Cell & Molecular Biology, 2013, 74(1):174–183.

 

參考文獻

  1. Michelmore, R.W., Paran, I. & Kesseli, R.V. Identification of markers linked to disease-resistance genes by bulked segregant analysis: a rapid method to detect markers in specific genomic regions by using segregating populations. Proceedings of the National Academy of Sciences88, 9828-9832 (1991).
  2. Austin, R.S. et al. Next-generation mapping of Arabidopsis genes. Plant Journal for Cell & Molecular Biology67, 715 (2011).
  3. Sun, H. & Schneeberger, K. SHOREmap v3.0: Fast and Accurate Identification of Causal Mutations from Forward Genetic Screens. Methods in Molecular Biology1284, pp 381-395 (2015).
  4. Takagi, H. et al. QTL-seq: rapid mapping of quantitative trait loci in rice by whole genome resequencing of DNA from two bulked populations. Plant Journal74, 174-183 (2013).
  5. Takagi, H. et al. MutMap accelerates breeding of a salt-tolerant rice cultivar. Nature Biotechnology33, 445 (2015).
  6. Abe, A. et al. Genome sequencing reveals agronomically important loci in rice using MutMap. Nature Biotechnology30, 174-178 (2012).
  7. Fekih, R. et al. MutMap+: genetic mapping and mutant identification without crossing in rice. 8, e68529 (2013).
  8. Takagi, H. et al. MutMap-Gap: whole-genome resequencing of mutant F2 progeny bulk combined with de novo assembly of gap regions identifies the rice blast resistance gene Pii. New Phytologist200, 276 (2013).

 

 

農林特色服務——全基因組關聯分析

一、全基因組關聯分析概述

全基因組關聯分析(genome-wide association studies,GWAS)是一種在全基因組水平上將大量樣本的表型和基因型進行對照分析或相關性分析,從而對復雜性狀進行基因定位的方法。目前,GWAS已經成為動植物數量性狀位點(quantitative trait locus,QTL)精細定位的重要手段。隨著越來越多的物種全基因組測序完成,GWAS將更廣泛地應用于育種和進化領域。

在動植物QTL定位的研究設計中,根據樣本材料來源不同可分為雜交家系材料和自然群體材料。在家系材料中,主要使用連鎖分析方法考察重組事件帶來的連鎖。由于家系傳代次數和樣本數受限制,可供觀察的重組事件有限,因此定位的結果通常位于一段較長的染色體區間內。而在自然群體中,使用的是關聯分析方法來考察群體中存在的連鎖不平衡。相對于雜交家系有限的傳代次數來說,自然群體中蘊藏著豐富的重組事件。因此,關聯分析定位的精度要遠高于連鎖分析。但是,由于不同地理群體間存在著的遺傳分化也會帶來連鎖不平衡,關聯分析的假陽性將高于傳統的連鎖分析。

 

二. 技術路線

 

三. 實驗參數

實驗方法:全基因組重測序 / SNP基因芯片

樣本數量:最少 > 200個,推薦 > 500個

測序深度: > 5X(樣本數 < 500);大于500個樣本可適當降低測序深度

測序平臺:Illumina Hiseq

 

四. 結果展示

 (a) 數據質控

對SNP位點的質控(例):去除MAF < 0.01的數據,去除位點call-rate < 0.9的數據,并去除顯著偏離哈溫平衡的位點(HW-p < 10-6)。

對樣本的質控(例):個體call-rate < 0.9、個體常染色體異質性(FDR < 0.01)、剔除親緣關系較近的個體(IBS > 0.95)。

 

(b) 數量性狀正態分布檢驗

對于質量性狀,采用case-control分析(性狀只有0和1);對于數量性狀,數據需要驗證是否符合正態分布,并將不符合正態分布的數據轉換為正態分布的結果。樣本量如小于2000,結果以Shapiro-Wilk檢驗為準,Sig<0.05則需要進行數據轉換。

表3. 數量性狀正態性檢驗(示例)

 

對Sig. < 0.05的Trait4和Trait7進行正態轉換,得到以下結果:

表4. 數量性狀轉換后正態性檢驗(示例)

 

(c). 關聯分析

使用線性回歸模型進行全基因組關聯分析,公式為y = Xα+ Zβ + Wμ+ e,其中y為表型性狀;Xα為固定效應,即影響y的因素如群體分層、性別年齡等可預測因素;Zβ為標記效應;Wμ為隨機效應,一般指個體親緣關系。

對所得p值進行多重檢驗校正,以校正后的p值計算Q-Q plot和生成曼哈頓圖。

 

(d). Q - Qplot

Q-Q plot 即Quantile-Quantile Plot,主要是直觀的表示觀測值與期望值之間的差異,可直觀的看出顯著位點情況。位點值為經過校正后的p值。理論上每個點在Q-Q plot中應該是觀測值與預測值相等,這時可得到一條斜率為1的直線。如偏離直線則說明此SNP點出現了偏離。

圖11. Q-Qplot圖(示例)

 

(e). 曼哈頓圖

使用R軟件包進行曼哈頓圖的繪制。橫坐標為各SNP位點在染色體上的位置,縱坐標為p值的負對數值。設置閾值,篩選顯著相關的位點作為候選位點。

圖12. GWAS分析結果(示例)

 

(f). 顯著位點功能注釋

對以上篩選得到的顯著位點進行功能注釋,得到該位點對應的基因以及該基因的功能。

 

五. 研究案例

案例四 借助Affymetrix Axiom平臺使用GWAS研究雞攻擊行為相關基因7

攻擊行為是很多物種共有的進化屬性,它可以幫助雄性物種快速建立生存空間或社會主導地位。然而可想而知,這種屬性在禽類的飼養中是十分不利的。之前已有一些研究表明雞的攻擊行為可由遺傳因素導致,并估計了遺傳力大小約為0.57,說明群體中一半以上的攻擊行為是由遺傳導致的。作者試圖使用GWAS方法來探究攻擊行為背后的遺傳因素,以期改善養殖效率和動物福利。

研究共使用了265只雄性家雞,在出生第60天時開始測量攻擊性狀,共4個,分別為T1:在記錄期間(16天)內打斗的次數;T2:每天打斗的次數(超過4次則被記錄);T3:打斗的天數;T4:超過4次打斗的天數。基因分型工作由上海伯豪完成,使用了Affymetrix Axiom平臺的高密度芯片,型號為600K Affymetrix Axiom HD chicken genotyping array,共生成了599,898個SNP位點。經過質控后,保留468,020個SNP用于GWAS分析。結果共得到33個顯著位點,涉及26個基因。

圖13. T1-T4四個攻擊行為性狀的Manhattan圖,藍和紅色線分別表示P=4.6E-6和P=2.3E-7

 

作者使用了Ingenuity Pathway Analysis(IPA)對26個相關基因進行代謝通路分析,根據基因互作網絡進一步得到9個基因,其中SORCS2基因與多個基因互作,可能具有重要功能。在80個顯著代謝通路中,“行為”相關通路排第26位。接下來,作者選擇了SORCS2基因進行后續驗證。

圖14. Ingenuity Pathway Analysis(IPA)得到的9個基因。其中,SORCS2基因與多個基因互作,可能具有重要功能

 

在IPA分析中,SORCS2基因與NGF, NGFR, L-dopa and dopamine四個基因相關,而NGF已在小鼠中被證明其表達量與攻擊行為相關。于是,研究在雞成纖維細胞系DF-1中敲降了SORCS2基因的表達量,觀察到了NGF, NGFR, L-dopa基因的表達量也隨之降低,其中NGF, L-dopa和多巴胺受體基因家族DRD1-DRD4顯著下降,但NGFR下降量并不顯著。此結果顯示SORCS2基因可能會影響多巴胺通路的表達,從而影響到雞的攻擊行為程度。

 

圖15. 左圖:NGF, NGFR, L-dopa基因由于SORCS2基因敲降而降低;右圖:多巴胺受體基因家族DRD1-DRD4由于SORCS2基因敲降而降低

 

文章對比了攻擊行為程度高的和低的雞個體的SORCS2基因表達量,發現在攻擊行為程度高的雞個體中,SORCS2基因表達量顯著高于攻擊行為程度低的雞個體。這個結果進一步說明了SORCS2基因可能在雞攻擊行為中扮演了重要的角色。

圖16. 攻擊行為程度高的雞個體中SORCS2基因表達量顯著升高

 

研究使用了265只雄性家雞,通過Affymetrix Axiom基因分型平臺進行SNP分型,得到大量高密度SNP位點進行GWAS分析,得到33個候選位點。通過Ingenuity Pathway Analysis(IPA)代謝通路分析,將研究對象聚焦到少數幾個基因上,并通過使用DF-1細胞系進行表達量驗證,結果說明了SORCS2基因與雞攻擊行為之間的關系。

 

原文出處:Li ZH, Zheng M, Abdalla A, et al. Genome-wide association study of aggressive behaviour in chicken. Scientific Reports, 2016.

 

 


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