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【伯豪文獻】多組學思路-散發病例如何發高分

2019-05-23點擊85次
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上海交通大學醫學院附屬新華醫院小兒心血管研究團隊在學術期刊Genome Medicine(影響因子8.898)上發表了新的內臟異位候選基因的研究成果,闡明新發現的候選基因在左右軸不對稱發育中的重要作用。


研究背景

內臟異位(Heterotaxy)是一組廣泛累及心臟及眾多心外器官的綜合畸形,大約90%的Htx患有嚴重的先天性心臟病。遺傳學研究表明是因胚胎期內臟左右體軸非對稱結構的無法正常建立而導致的綜合征,可分左側異構及右側異構。隨著對該病認識和檢測方法的提高,越來越多的內臟異位綜合征被早期甚至胎兒期確診。目前內臟異位綜合征并發心臟畸形的治療效果并不理想,并且大多數Htx病例的潛在病因和機制仍然未知,因此通過分子生物學的技術探究致病機制尤為重要。


研究思路

本項研究首先對散發的Htx患者進行Affymetrix CytoScan HD芯片分析,發現新的罕見拷貝數變異,然后結合WES(使用上海伯豪全外服務)進一步分析變異片段上的基因尋找可能的致病基因,并通過斑馬魚原位雜交、反義嗎啉環寡聚核苷酸基因敲降技術、mRNA過表達、CRISPR/ Cas9技術,闡明候選基因在左右軸不對稱發育中的重要作用。


研究結果
1、本研究首次發現Htx患者中的19種罕見CNV,包括5個雜合性缺失,4個基因區段的重復以及10個至少包含一個基因的重復區段。對19種罕見CNV進一步分析鑒定出了6種與左右分化有關的新的潛在候選基因(NUMB,PACRG,TCTN2,DANH10,RNF115和TTC40)。

2、斑馬魚作為一種模式生物用于進一步研究基因的功能。使用地高辛標記的RNA作為探針的WMISH進行斑馬魚兩個發育階段分別是8-10體節期(受精后13-15小時[hpf])和原基5期(24 hpf,心臟開始搏動)的基因表達模式研究,發現PACRG基因在兩個發育階段均有表達,8-10體節階段是在KV中表達,原基5期則表達于pronephric duct 和floor plate(圖2a,b)。8-10體節階段numb,rnf115,dnah10和cfap46普遍表達(圖2c,e,g,i);然而在原基5期,這些四個基因表現為更局部化的表達模式:numb和rnf115在大腦中都表達(圖2d,f) dnah10僅限于脊索(圖2h), cfap46在floor plate和pronephric duct表達(圖2j)。



3、為了進一步研究候選基因的表達對心臟的影響,使用MO敲降技術來處理這些候選基因。在斑馬魚胚胎單細胞階段注射MO,并且在48hpf評估心臟循環。發現6個候選基因中有5個基因的MO敲降后導致心臟循環發生了顯著變化。與陰性對照(2.35%)相比,numb、pacrg、tctn2、dnah10和rnf115的表型差異顯著,有13.16-26.2%的胚胎表現出L環或無環(圖3b)。DNAH10和RNF115是人和動物中新被發現的的候選Htx基因。CRISPR/ Cas9結果發現明顯會導致F0胚胎中異常心臟循環現象(圖3c,P <0.001)。基因過表達實驗分析對心臟的影響也發現擾亂了心臟循環(圖3d)。值得注意的是,rnf115 MO敲降導致14.3%的異常心臟循環,注射rnf115的mRNA可以緩解心臟紊亂現象,這表明該基因在左右軸中具有特定功能。


4、異常的心臟循環模式可能是由早期常見側向通路的破壞或特定心臟場效應引起的。基于候選基因的早期表達模式和患者多個器官錯位的臨床信息,作者假設異常的心臟循環表型是由LR發育過程中早期信號通路的破壞引起的。為了驗證這一假設檢測了作為18-22體節早期常見側向通路的標志基因pitx2和lefty2的表達模式。結果發現rnf115 morphants 的PITX2異常表達(28.0%,P <0.001),但lefty2沒有異常表達。然后再分析了numb, pacrg, tctn2過表達胚胎中pitx2和lefty2的表達情況,pitx2和lefty2也顯著異常表達。


研究結論

罕見拷貝數變異是引起散發內臟異位發生的重要原因。本研究首次發現Htx患者中的19種罕見CNV,包括5個雜合性缺失,4個基因區段的重復以及10個至少包含一個基因的重復區段。對19種罕見CNV進一步分析鑒定出6種與左右分化有關的新的潛在候選基因(NUMB,PACRG,TCTN2,DANH10,RNF115和TTC40)。該研究不僅發現了新的罕見拷貝數變異,更重要的是首次發現DNAH10、RNF115這2個基因參與左右軸不對稱發育過程,拓寬了對內臟異位綜合征發病機制的認識。通過在斑馬魚中的進一步功能驗證,闡明dnah10、rnf115、tctn2、pacrg和numb這5個基因通過影響左右體軸分子標志物pitx2/lefty2的表達模式,進而調控心管的環化。該研究將為內臟異位綜合征的診斷與治療提供理論依據與靶點,進而有望為提高我國人口質量、降低新生兒先天畸形、提高兒童健康水平發揮積極的作用。


參考文獻
[1] Liu C, Cao R, Xu Y, et al. Rare copy number variants analysis identifies novel candidate genes in heterotaxy syndrome patients with congenital heart defects[J]. Genome medicine, 2018, 10(1): 40.
[2] 孫妍,王健鵬,李慧,等.內臟異位綜合征的研究進展.2016,31(2):203-205

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