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Milliplex樣本收集指導

所有樣本建議分裝凍存,避免反復(>2)凍融,儲存時間超過1年的樣本需要評估
1.血清樣本的制備
?采集血液樣本,將其置于不含抗凝劑的試管內至少30min
?以1000g離心10min,仔細收集血清
?將血清置于標記有日期、采集時間、和病歷號的試管內
?立即操作、合理冷藏或冷凍樣品
?當天收集的血清如果當天需要測試,需要保存在4℃中,如果隔天測試,或者更久,則需要分裝后保存在-80℃。

2.血漿樣本的制備
?采集血液樣本,置于含有適量抗凝劑的試管內
?室溫靜止30min
?以1000g離心10min(血樣采集后30min之內進行)
?將血漿置于標記有日期、采集時間、動物名稱和病歷號的試管內
?立即操作、冷藏或冷凍樣品
注:避免唾液污染,不要使用肝素或檸檬酸鈉抗凝

? 唾液污染:唾液可能含有高豐度的某些心血管相關標志物 ( MPO, SAA, and Lipocalin-2/NGAL),導致結果不準確。
? 肝素(heparin)或檸檬酸鈉抗凝抗凝:可導致Troponin-I 和 troponin-T 偏低(吸附導致)VEGF, MCP-1, eotaxin, factor VII偏高等



3.細胞培養上清樣本處理
?3000g x離心10分鐘,收集上清
?若樣本需要稀釋,請準備稀釋液
?分裝凍存≤-20°C 或者≤-70° C


注意事項:
?建議培養細胞時準備復孔(避免邊緣效應)。
?血清中含有某些細胞因子,建議使用無血清或低血清條件培養基。
?不同細胞可根據生長狀況確定培養時間。


4.尿液樣本處理
?日間取尿液至無菌容器中。
?10000g,離心5分鐘。
取上清分裝凍存(無須防腐劑)。


注意事項
? 分裝凍存,避免反復凍融。
? 收樣后及時處理保存
? 根據需要取晨起的中段尿.


5. 房水樣本處理
? 前房穿刺取樣(paracentesis of the anterior chamber)。
? 轉移至冰上無菌EP管中。
? 16000g,4度離心5分鐘(目的是去除除細胞雜質)
? 取上清分裝凍存。 


注意事項
? 盡量在4冰上及4度環境中處理樣本。
? 分裝凍存,避免反復凍融。


6. 痰液樣本處理
? 漱口及取痰液至50ml無菌離心管中。
? 4度保存并于2小時內處理。
? 稱重并加4倍體積的0.1%二硫蘇糖醇(PBS或生理鹽水等)并混勻。
? 37°C震蕩孵育15分鐘(每5分鐘移液器吹打混勻)。
? 48μm的尼龍網過濾后790g,室溫離心10分鐘。
? 取上清分裝凍存。


注意事項
? 盡量取出樣本后2小時處理保存
? 建議加入蛋白酶抑制劑 (PMSF) (Sigma) ,EDTA (Sigma Diagnostics)


7. 灌洗液樣本處理
? 灌洗樣本采集一般采用無菌生理鹽水、PBS、Hank’s液作為灌洗的buffer。
? 使用注射器吸取上述灌洗液在灌洗的器官上反復沖洗3-5次,灌洗液的體積可以根據具體情況進行調整,例如:大鼠可以每次5ml重復注入-回抽操作3次,15ml約可回收9-12ml灌洗液(總回收率60-75%)。
? 如收集的灌洗液中含有雜質,可以使用離心機1000轉/分鐘離心10 分鐘,收集上清。
? 將收集到的灌洗液樣本分裝后,放入-80°C進行保存。


8. 關節滑液樣本處理
? 常規采取關節腔穿剌術抽取關節滑液。
? 無菌注射器,抽取膝關節滑液.5ml以上注入EP管中。
? 4℃、3000r/min離心10min,取上清液封蓋。
? 將收集到的關節滑液樣本分裝后,放入-80°C進行保存


9. 腦脊液本處理
? 側臥位腰椎穿刺術
? 4°C,1500g離心15分鐘,收集上清,≤-20°C保存在無菌管中 (建議樣本在-20°C保存不超過一個月,如超過一個月,盡可能把 樣本保存在-80°C中)。 


注意事項
? 盡量在4冰上及4度環境中處理樣本。
? 分裝凍存,避免反復凍融。
? 放棄被血細胞污染的CSF。血液細胞污染的標準為:500個/ul 。
? 離心后樣本應該立即分裝凍存,間隔時間不超過2h


10. 裂解液樣本處理 蛋白裂解液:40-030
10.1. 樣本裂解液收集處理(1-5mg/ml)(懸浮細胞或組織)
? 新鮮組織:將組織分離后, PBS清洗3遍,液氮速凍,-80保存,備用
懸浮細胞:離心收集胞沉,并用PBS清洗3遍,-80保存,備用
? 準備細胞或組織,組織樣本盡量將所有樣本重量統一。
? 將組織樣本加入液氮進行研磨(細胞樣本不需要)。
? 加入冰預冷的1×Milliplex MAP 裂解液( Cat.No.43-040,用前加蛋白酶抑制劑),裂解液用量根據不同樣本進行調整。
? 離心或者濾膜過濾去除雜質碎片,
濾膜選擇建議:
? ≥2ml,采用EMD Millipore Catalog#SLPBDZ5NZ
? 0.5-2ml,采用EMD Millipore Catalog#UFC0DV25
? ≤0.5ml,采用EMD Millipore Catalog#UFC30DV00
? 將裂解液進行總蛋白定量,并將濃度調整為1到25μg總蛋白 (25μl 40-1000μg/毫升)。總蛋白量的10μg/孔是比較常 用的濃度。
? 收集裂解液加入蛋白酶抑制劑(20-201 Protease Inhibitor Cocktail),-80°C保存。
注意事項:
? 盡量在冰上及4度環境中處理樣本
? 分裝凍存,避免反復凍融。
10.2.細胞裂解液收集處理:(40ug/ml-1mg/ml)(貼壁細胞)
? 預冷PBS(TBS)清洗細胞
? 加入裂解液(使用前加蛋白酶抑制劑,建議裂解液用量如下:(150 mm培養皿中加0.6ml裂解液, 0.3 mL per 100 mm培養皿中加0.3ml裂解液, 24孔板每孔加 0.1 mL裂解液).
? 刮下細胞并轉移至離心管中,4度輕柔震蕩10-15分鐘。
? 通過過濾或者離心方式取上清
? 取部分進行蛋白定量
? 其余部分分裝凍存




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