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Full moon芯片常見問題

1. Q:蛋白芯片和蛋白質芯片兩者有什么區別?

A:蛋白芯片包括抗體芯片和蛋白質芯片兩個大類。抗體芯片是由多個抗體形成的微陣列,可以區分混合樣本中多種不同蛋白質的表達豐度或者修飾比例,是進行特定多個蛋白質表達和磷酸化篩選的首先技術。
蛋白質芯片是由多種純化的全長蛋白質形成的微陣列,其檢測原理主要是基于芯片上蛋白質的結構特性和蛋白互作的生物活性。一般在篩選某種特定的蛋白質、核酸、小分子藥物或糖脂等分子所結合的它種蛋白質時,蛋白質芯片尤為適用,成為pull-down加質譜實驗體系的很好補充和替代技術。同時,研究人員還可以用蛋白芯片篩選自身免疫病或者腫瘤病人血清的自身抗體,以作標志物之用。另外,還可以在芯片上進行酶與底物反應實驗,從而確定修飾酶的底物譜。總之,蛋白芯片技術衍生的產品已經非常豐富,可以解決的科學問題也非常多,是未來蛋白研究領域的常規技術。

2. Q: 蛋白芯片和質譜技術,哪種技術比較好?客戶該如何選擇?

A:質譜技術與蛋白芯片技術是蛋白組學研究領域中兩種最主要的技術類型,兩種技術各有優點。質譜技術的應用方向更偏組學性質,可檢測的蛋白類型和數量比較廣泛,并且通過質譜技術可以發現新的蛋白質或蛋白修飾形式,或者是檢測人、大鼠、小鼠等常用模式生物之外其他物種的蛋白變化(如細菌、植物等)技術。
蛋白芯片技術是高通量技術與分子生物學技術結合的產物,其應用方向更偏向于大批特定檢測目標的篩選,篩選精度較質譜更高。由于蛋白芯片在設計時就已經根據蛋白的功能屬性進行了歸類,檢測指標的背景資料也更為豐富。因此,在數據解析難度上蛋白芯片較質譜、測序等其他組學技術要低很多。較質譜而言,蛋白芯片與Western和ELISA等方法在檢測原理上更為接近,用Western等方法對蛋白芯片數據的驗證效率較質譜更高。

3. Q:蛋白芯片可以應用于哪些研究領域?

A:蛋白芯片主要分為抗體芯片和蛋白質芯片兩大類,前者是不同的抗體形成的微陣列,可以用來高通量相對定量或絕對定量檢測某一類型的蛋白質,是疾病的發生、發展的機制研究以及疾病標志物篩選等研究的有力工具;蛋白質芯片是不同種類的蛋白質形成的微陣列,是功能性芯片的代表。可以進行疾病診斷標志物、抗體特異性、藥物靶點等篩選研究,以及蛋白質與蛋白質、核酸、小分子藥物、糖類、脂類等的相互作用檢測。同時,還可以在此類芯片上進行復雜的酶與底物反應實驗,從而確定酶的底物譜,進而廣泛用于磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化等蛋白修飾研究。

4. Q:蛋白芯片的靈敏度、重復性、動態檢測范圍怎樣?

A:蛋白芯片基本采用熒光檢測,其靈敏度要比ELISA(比色法)、Western(化學發光法)更加靈敏和穩定。片內和片間的技術重復相關系數R2均可以達到0.9以上。定量檢測其檢測范圍與標準品的線性范圍有關,檢測靈敏度可達到 pg/mL級別。

5. Q:蛋白芯片結果準確嗎?

A:相比質譜技術,蛋白芯片原理就是抗原抗體反應的高通量化,與經典的Western和ELISA從技術原理上具有更強的可比性。蛋白芯片上設置有多種技術重復和質控參照點,有效保證芯片數據的可靠性。另外,蛋白芯片還具有檢測指標功能集中化的特點,在數據分析的時候,得到的結果不再是某個蛋白差異變化的孤立數據,還可獲得同類蛋白變化的完整證據鏈,比如信號通路上下游協同調變的數據。

6. Q:蛋白芯片可以給出定量結果嗎?

A:蛋白芯片可以給出定量結果。一般情況研究目的僅為比較對照樣本間某些指標的差異,通過差異反應和解釋生物現象則只需要進行半定量檢測。一般檢測生物流體里的蛋白質,尤其是分泌蛋白,需要進行絕對定量檢測,進行絕對定量檢測方便后續臨床應用的轉化過程,以及與現有文獻進行對比。

7. Q:信號通路抗體芯片是怎么檢測信號通路的?

A:信號通路抗體芯片/蛋白芯片針對每一條信號通路,如p53:從細胞膜到胞漿到核內,參與整條信號通路的蛋白質均設置抗體進行檢測,針對某些蛋白會有多個磷酸化位點的情況,我們也會設置多個磷酸化位點的特異抗體進行檢測。將這些抗體固相結合到一張芯片片基上,以實現對于一個樣本中整條p53通路的檢測。同時,我們還設計有廣譜篩選抗體芯片/蛋白芯片,將多條信號通路中的相關蛋白特異抗體固相結合到芯片片基上,從而實現對信號通路蛋白的廣譜篩選。

8. Q:在磷酸化抗體芯片中,為什么往往一個蛋白會有多個抗體對應?

A:由于一個蛋白質往往具有不同的磷酸化位點,這些位點的不同磷酸化水平又對應不同的功能狀態。而我們抗體芯片/蛋白芯片上的抗體是特異針對每個磷酸化位點的,因此一個蛋白由于具有多個磷酸化位點往往會有多個抗體對應。例如 c-Jun(Phospho-Thr91) 只檢測 c-Jun 的Threonine 91 的磷酸化狀態,而 c-Jun(Phospho-Tyr170) 只檢測 c-Jun 的 Tyrosine 170 的磷酸化狀態。

9. Q:蛋白芯片抗體列表中經常會有這樣的情況 p53(ab-15) 或者 p53(phospho-Ser15) ,應該怎樣理解?

A:括號中的數字說明這是該蛋白的磷酸化位點位置。 p53(Ab-15) 和 p53(phospho-Ser15) 的區別是:抗體 p53(Ab-15) 是使用圍繞 p53 Serine 15 位點周圍的一段合成的多肽制備的,其中 Serine 15 為非磷酸化狀態;而抗體 p53(phospho-Ser15) 也是使用圍繞 p53 Serine 15 周圍的一段合成的多肽制備的,而其中 Serine 15 位點為磷酸化狀態。因此抗體 p53(Ab-15) 只能識別非磷酸化狀態 Serine 15 ,而抗體 p53(phospho-Ser15) 可以識別磷酸化狀態 Serine 15,這兩個抗體在蛋白芯片上是配對的.

10. Q:蛋白芯片實驗,樣本裂解需要加入蛋白酶抑制劑嗎?

A:抗體芯片/蛋白芯片的配套裂解試劑中是不含蛋白酶抑制劑的。樣本取來后,會在低溫快速的情況下完成蛋白質提取、標記以及雜交過程。如果您需要自己裂解樣本,那么推薦您在蛋白質裂解過程中加入蛋白酶抑制劑。

11. Q:可以使用除了抗體芯片配套試劑盒中的提取緩沖液以外的蛋白裂解試劑嗎?

A:是的,在抗體芯片/蛋白芯片實驗中,細胞或者組織裂解獲得蛋白質的過程中是可以使用各種緩沖液的(如:RIPA裂解液),但是這些緩沖液不能包含 Tris 。因為 Tris 組分會影響到下一步的蛋白質標記步驟。因此,在使用含有 Tris 組分的緩沖液獲得蛋白質之后,推薦使用 Millipore, Microcon YM-10 filters (Catalog: 42406) 或者 Sephadex G-25 columns 置換成標記緩沖液體系。

12. Q: 蛋白芯片實驗使用細胞樣本,獲得100 ug總蛋白需要多少細胞?

A:由于細胞類型不同,每個細胞的蛋白含量也不盡相同。我們通常蛋白芯片實驗中使用 10^6 - 10^7 的細胞可提取大約 1 mg蛋白質,其中大約 100ug 用來進行標記與雜交,因此我們推薦提供 5X10^6 細胞用于抗體芯片檢測。

13. Q: 相對于傳統的WB、ELISA,蛋白芯片有哪些優勢?

A:蛋白芯片采用熒光標記進行檢測,而WB采用化學發光、ELISA采用比色法進行檢測,無論檢測靈敏度還是信號穩定性,熒光標記都更勝一籌,這也是生物領域中大量檢測設備采用熒光法的原因。相對于WB和ELISA,采用抗體芯片/蛋白芯片的方式進行相關細胞因子的檢測,檢測范圍和靈敏度外更高。高通量是蛋白芯片最大的優勢,不僅經濟省時,還使得檢測數據更加具有橫向可比性。

14. Q: 藥物機理研究,應該先檢測蛋白差異還是磷酸化?

A:由于大部分藥物是在膜上和胞漿內都起作用,主要是影響信號通路活性,所以一般情況下先檢測磷酸化水平可能會更好,信號通路磷酸化抗體芯片可以對單/多條信號通路進行綜合評價,在省時省力的同時提高了數據的完整度和科學性,幫您在最短的時間內定位到您關注的實驗現象中受到擾動的關鍵信號通路和通路中的信號分子。如果您確定藥物是直接入核,調節相關基因表達,您也可以先檢測蛋白差異變化,可以采用蛋白表達篩選芯片和iTRAQ質譜技術。

15. Q:蛋白芯片如何應用于腫瘤研究?

A:很多研究人員在研究過程中發現其研究的腫瘤中,多條信號通路都可能發生改變,針對這種情況需要用廣譜的抗體芯片/蛋白芯片進行多信號通路篩選。推薦腫瘤信號通路廣譜篩選抗體芯片CSP100和細胞磷酸化譜篩選抗體芯片PEX100。

16. Q: 客戶該如何選擇蛋白芯片產品?

A: 如果您的檢測目標在一些功能比較聚焦的蛋白芯片上,您可以有針對的選擇相關蛋白芯片產品,而不一定只追求高通量。如果您的實驗還處于起步階段,想通過蛋白芯片找到合適的蛋白類型,則可能需要進行大規模的高通量蛋白芯片篩選實驗。另外,如果實驗材料為細胞,由于樣本組別較少則選擇固相芯片比較合適。如果實驗材料為臨床或動物樣本,可以選擇液相懸浮抗體芯片/蛋白芯片進行相對高通量的多樣本檢測。

17. Q: 蛋白芯片是否可以用于臨床診斷?蛋白芯片檢測結果是不是可以直接發文章?

A: 目前蛋白芯片主要用于臨床前期的科學研究,一旦相關實驗結果得到認可,在形成具體產品以后可以投入臨床運用,但需要有行政批文。由上海數康生物科技有限公司研發的應用于臨床檢測的腫瘤標志物蛋白芯片(C-12)即是較好的蛋白芯片已經在臨床開展應用,是未來蛋白芯片技術進入臨床領域的典型應用案例。目前應用蛋白芯片發表的研究類文章已經非常多,從這些文獻看來,蛋白芯片一般定位還是蛋白篩選工具。先對少量樣品中的大量蛋白質進行差異蛋白質分析,找到目標蛋白質后,再利用傳統的Western blot以及ELISA驗證更多樣品中的目標蛋白表達情況,從而獲得可靠數據以證實論文觀點。蛋白芯片技術可以極大提高科學研究的效率,更能夠獲得較為全面的數據,以在研究中得到創新的結果和結論,是科學論文發表的加分項。

18. Q:基于bDNA技術的蛋白磷酸化檢測服務Procarta SH2 Domain Plex Kit與FullMoon的磷酸化蛋白芯片在有哪些差別?檢測的數量和結果有什么差別? 

A:我們現在液相芯片只做Merck的Milliplex,不做Procarta了。
區別:液相芯片是在不同顏色標記的微珠上包被捕獲抗體,捕獲抗原后,再用抗原的檢測抗體對抗原進行檢測,最后通過儀器識別微珠收集抗體信號的強度,進而對抗原的種類和含量進行檢測,液相芯片適合做樣本數比較多(一塊板可以做80個樣本,做二重復的話,可以做40個樣本),因子數不太多(比如10多個)的項目。固相芯片是直接在玻璃片上分別點了大量蛋白磷酸化抗體和非磷酸化抗體。通過檢測樣本中抗原與兩種抗體結合的比值來看不同樣本間的差異。固相芯片因子數較多,但因子不能隨意組合,單張芯片只能做一個樣本。

19. Q:公司提供Full Moon的Protein Extraction Buffer 或者RIPA Lysis Buffer么? 

A:我們可以提供專用的Protein Extraction Buffer,但裂解后的樣品不穩定性增強,建議客戶直接送細胞沉淀或組織塊,由公司進行蛋白的提取。

20. Q:客戶的樣本是兩個細胞系,如果做FullMoon公司的蛋白磷酸化芯片,客戶應如何提供樣本,實驗周期要多久?

A:做FullMoon公司的蛋白磷酸化芯片,需要收集1×106以上的細胞,用預冷1×PBS洗滌3-5遍后,離心收集細胞沉淀,-80℃冷凍保存即可。
試驗周期:從收到樣品開始計算,如果芯片有現貨,試驗周期為3-4周,如果芯片沒有現貨,試驗周期為9-10周。

21. Q:恒河猴線粒體能量代謝相關蛋白芯片有哪些?是否有氧化損傷的蛋白芯片?這些芯片是否可以做人的蛋白?

A:能量代謝相關的芯片,華盈目前只有一款AMPK信號通路蛋白磷酸化芯片(PAM174),或者可以使用信號通路磷酸化廣譜篩選抗體芯片(PEX100)進行篩選;氧化損傷相關芯片目前還沒有,但是信號通路磷酸化廣譜篩選抗體芯片(PEX100)可以作為備選,這個芯片包括30個信號通路的432個蛋白的679個磷酸化位點。以上這些芯片是人猴通用的。

22. Q:有客戶想咨詢蛋白芯片服務,樣本類型是大鼠腦組織,檢測蛋白磷酸化程度,推薦哪個服務?有什么需要客戶提供的信息嗎?價格或成本差別大嗎?

A:一般可供選擇的有xMAP技術和蛋白固相芯片(磷酸化芯片),xMAP項目檢測因子數多,一次可以檢測80個樣本的80種基因或50種因子,所需樣本量少,只需要50 ul即可,適合因子數比較多,樣本數比較多,樣本比較珍貴的項目。蛋白固相芯片是將抗體點在載玻片上,加入樣品,進而檢測樣品中相關因子的水平(包括磷酸化水平),一張芯片只能做一個樣品,但一張芯片檢測的因子數多,適合單個樣本量大,樣本數少,檢測因子比較多或特定通路的磷酸化狀態的項目。需要樣品種屬,樣品類型,檢測因子,樣品數量,單個樣品量等,我們要先根據這些信息查詢是否可以檢測,然后進行價格和成本核算。

23. Q:Signaling Explore Array(SET100)和Phospho Explorer Array(PEX100)這兩款芯片有什么不同?客戶應該怎么選擇?

A:首先,這兩款芯片的抗體數不同,SET100包含1358種抗體,只能檢測人的樣本,PEX100包含1318種抗體,可檢測人,小鼠,大鼠;其次,這兩款芯片的目的不同,SET100包含20多種信號通路,目的是通過高通量篩選和發現新的Biomark,它的Target protein按照蛋白家族分類,是為了研究樣本處理后影響了哪個蛋白家族的哪個蛋白,進一步通過哪個信號通路來影響表型的,可以精確到蛋白亞型。PEX100的目的也是通過高通量篩選和發現新的Biomark,但這個芯片Target protein是按照蛋白的的磷酸化位點分類,是研究樣本處理后影響了哪個蛋白的哪個位點的磷酸化,進而影響了哪條信號通路來影響表型的,可精確到某個蛋白的磷酸化位點。客戶可根據需要進行選擇。
在選擇時應該考慮以下幾個方面:
1. 確定研究目的是什么?是研究磷酸化位點?還是研究蛋白亞型?
2. 是否明確要研究的信號通路?不明確要研究的信號通路,一般選用廣譜篩選芯片,明確要研究的信號通路,一般選用相應的信號通路芯片,但一定要查看Target protein是否包含要研究的位點,如果不包含,則需要重新考慮研究方案。

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