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基因組-基于Fluidigm BioMark系統的基因分型檢測

基于Fluidigm BioMark系統的基因分型檢測介紹

Fluidigm高通量基因分析系統(BioMark?),是集成了流體通路(Integrated Fluidic Circuit,IFC)技術、實時定量PCR技術及強大的基因分析軟件的技術平臺。IFC 將微流控通道、閥門和反應倉集成在一張芯片上,通過一個控制系統自動完成多達9216個PCR反應。集成流體通路技術極大地簡化了生物樣品和試劑的分液操作,提高分析通量和靈敏度,其納升級的反應體系為高通量的基因分析應用節省大量成本、試劑用量和樣品需求量。

 

技術原理

Fluidigm的SNP檢測技術與Taqman類似,是基于終端熒光讀取判斷,每孔采用雙色熒光檢測一個樣本的一個位點可能的兩種基因型,不同的SNP模板對應不同的熒光產物。技術上的不同點在于,Taqman針對每一個特定SNP位點單獨合成帶兩種標記的探針,而Fluidigm的SNPType探針是由2條特異上游引物和1條通用反向引物組成,特異引物不帶熒光標記,反應體系中加入帶有FAM和HEX標記的通用探針,可以實現同時檢測多個SNP,從而大大降低了探針的成本。

  1. 準確度:Juno平臺的實驗原理與Taqman一樣,是基于實時定量PCR的技術手段,基因分型的準確率>99%。
  2. 特異性:Taqman探針,一般選用8-12bp長度在SNP位點兩端設計,可能導致多個同源序列擴增,引起背景增高,雜交信號降低,KASP的引物為24-26bp,特異性更高,SNP call rate 會更高,達到99.9%。
  3. 成本低:納升級的反應體系十分節省試劑;對于每一個特定位點單獨合成的探針,KASP的非熒光標記的引物,保質期長,而Taqman的針對特定位點的探針是熒光標記的,保質期短,成本高,用不掉會浪費。而KASP熒光標記的Master mix為通用型消耗品,可根據實驗用量酌情采購,不會浪費。
  4. 通量高:一次芯片最多可進行9216個反應。
  5. 靈活性:選擇已有探針或定制新探針,自由組合panel。任何種屬的相應序列,經過預擴增驗證后設計探針,有效提高低質量、低濃度或珍貴樣本的分析結果。

 

芯片規格類型

Biomark? HD系統配套的檢測芯片有如下幾種格式,滿足不同SNP位點和樣本數的研究需求,分別為:

  1. 12*12(12樣本*12位點);
  2. 48*48(48樣本*48位點);
  3. 96*96(96樣本*96位點);
  4. 192*24(192樣本*24位點)。

 

服務流程

方案設計——合同簽訂與送樣——樣本抽提質檢——探針引物預實驗——將樣本和SNPType引物試劑加到芯片上——將芯片置于Juno系統中,自動進行分液、混合和PCR反應——在Biomark HD上采集數據——軟件分析數據

 

樣本要求

  1. 樣品濃度50ng/μl-100ng/μl,體積5-10μl;
  2. OD260/280=1.8-2.0,OD260/230=2.0-2.4;
  3. 電泳主帶清晰,無明顯降解;
  4. 無蛋白和RNA污染;
  5. 特殊樣本,如FFPE等,可以降低條件,但是有風險。

 

儀器平臺

  • Fluidigm® BioMark? HD + Juno高通量基因分析系統

 

參考文獻

[1] Yang et al. Genetic variant of IL-10RA and susceptibility to rheumatoid arthritis in a Chinese population. Clin Rheumatol. 2017 Apr, 36(4):825-830.
[2] Ni et al. Genetic Polymorphism (rs329498) in the Pellino-1 Gene as Possible Predisposal Factor for Systemic Lupus Erythematosus in a Chinese Population. Immunol Invest. 2016 Mar 28:1-10.
[3] Chen et al. Role played by the SP4 gene in schizophrenia and major depressive disorder in the Han Chinese population. Br J Psychiatry. 2016 May, 208(5):441-5.
[4] Zhang et al. Associations of genetic variations in EYA4, GRHL2 and DFNA5 with noise-induced hearing loss in Chinese population: a case- control study. Environ Health. 2015 Sep 24; 14: 77.

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