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表觀組-Illumina 850k甲基化芯片

Illumina 850k甲基化芯片介紹

Illumina在原450K芯片巨大成功的基礎上,推出了新一代的DNA甲基化芯片Illumina Infinium MethylationEPIC BeadChip芯片(下文中以850K芯片代稱),為研究者提供了一個可靠且經濟高效的甲基化分析平臺。850K芯片可檢測人全基因組約853,307個CpG位點的甲基化狀態,其中包含了原450K芯片91%的位點,并增加了413,745個位點(圖 1)。850K芯片不但保持了對CpG島,基因啟動子區的全面覆蓋,還特別加強了增強子區(新增了333,265個探針覆蓋來自ENCODE及FANTOM5計劃的增強子)以及基因編碼區的探針覆蓋。廣泛應用于干細胞研究、腫瘤和其他復雜疾病研究,是一款適合表觀基因組全關聯分析研究的全基因組DNA甲基化芯片。


圖1 450K與850K的CpG位點數目比較

 

Illumina 850k甲基化芯片特點

  1. 覆蓋全面:檢測853,307個CpG位點;全面覆蓋CpG島、啟動子、編碼區及增強子;
  2. 無需“甲基化DNA免疫共沉淀”,亞硫酸氫鹽處理基因組DNA即可進行芯片實驗; Infinium探針設計,直接識別甲基化位點;
  3. 技術重復重現率>98%;
  4. 操作簡單,無須PCR擴增;模板量可低至250ng;
  5. 適用于FFPE樣品。

 

Illumina 850k甲基化芯片技術特點

  1. 流程簡單,無需進行繁瑣的免疫共沉淀;
  2. 單堿基分辨率;
  3. 通量高,可一次性檢測8個以上樣品;
  4. 全基因組覆蓋,對于未知功能區域及增強子同樣覆蓋;
  5. 只針對人類樣本;
  6. 數據準確,與焦磷酸平臺吻合度高。

 

Illumina 850k甲基化芯片技術流程

 

Illumina 850k甲基化芯片分析流程


 

Illumina 850k甲基化芯片技術參數


 

案例展示

案例一:《Journal of Clinical Oncology》報道早期肝癌術后復發可預測甲基化位點標記

在全世界分范圍內,每年因肝癌死亡的病例超過50萬人,是主要的因癌死亡病因之一。在過去的十年中,隨著影像學的進步以及健康體檢的普及,越來越多的肝癌病人在患病早期被發現。但由于肝臟捐贈者的短缺,外科肝臟切除術仍然是治療早期肝癌病人的最主要方法。本研究建立了一種預測早期肝癌病人術后復發的模型。

研究思路

1. CpG位點選擇
研究者首先采用焦磷酸測序技術驗證了450k芯片數據的再現性。通過分析66例病人的FFPE樣本和新鮮冷凍組織樣本發現,隨機選擇的兩個CpG位點甲基化水平呈現出高度的一致性。采用△β>0.15,FDR<0.01和p value<0.01這一標準,過濾450K芯片結果,得到2550個差異CpG位點。隨后,研究者為了區分高風險和低風險的病人,采用LASSO和SVM-RFE算法分別得到了30個差異最顯著的CpG位點。

2. 探究可預測的標簽
通過比較兩種算法得到的CpG位點,發現有14種是同時被鑒定出的,46種是不同的。通過分析46種不同CpG位點,把66例樣本分成復發和不復發兩個亞類。研究者隨后采用Cox回歸模型在訓練組中進一步縮小了E-HCC病人的甲基化檢測位點。結果發現,cg20657849(SCAND3), cg19406367(SGIP1), 和 cg19931348(PI3)三個甲基化位點與E-HCC病人復發高度相關。
隨后研究者采用焦磷酸測序技術,分別在訓練組和鑒定組中量化這一發現。為了更好的研究這三個CpG位點用來預測E-HCC復發的準確性,在訓練組中設定了一種危險系數評分。(risk score = (0.104 ×SGIP1甲基化水平) + (-1.125 ×SCAND3甲基化水平) + (-0.085 × PI3甲基化水平))研究發現,-0.401為risk score閾值。

3. 證實這一標簽
為了證實這一模型的穩定性,研究者分別在一組內部樣本和兩組外部樣本進行了檢測。在內部樣本中,該模型成功的分類了68例復發高風險病人,73例低復發風險病人。在外部樣本中,同樣成功分類了高風險和低風險病人。ROC分析發現,MSEH預測早期肝癌病人復發比三個CpG位點單獨檢測更有效。

4. 建立可預測的諾模圖
為了建立臨床上適用的用來預測個體復發的模型,綜合考慮了協變量后,研究者用諾模圖建立了可以用來預測的模型。基于RFS的多變量分析,研究者生成了一個諾模圖預測患者的5年生存率,通過三個校正點的檢測均得到理想結果。
本文通過分析早期肝癌患者甲基化芯片結果,得到三個與早期肝癌患者復發相關的CpG位點,并通過訓練組和驗證組優化了這一預測模式。最終,研究者建立了一種諾模圖,用來預測早期肝癌患者的術后復發風險。

尋找早期肝癌預后模型——作者背后故事

在廣州工作的一對堂兄弟,接連半年內相繼發現肝癌,這對一個家庭來說打擊巨大。不幸中的萬幸,腫瘤都小,兄弟兩診斷為早期肝癌。于是托了關系,找到知名教授手術,順利的完成手術。但令人意外的是,同樣接受根治性手術的早期肝癌,哥哥半年不到就復發了,慶幸的是弟弟一直沒有問題。
這樣的情況不僅僅出現在這對兄弟上,國內外研究均顯示即使早期肝癌,根治術后復發率都是接近一半。到底是什么原因導致的兄弟兩如此迥異的結局?這不僅困惑家屬,也同樣困擾著責任心極強的主刀大夫。分子生物學差異可能是背后的元兇,而如何在浩瀚如海的眾多基因中尋找差異,一直制約著轉化醫學進一步發展。
高通量大數據的技術為上述問題的解決提供了有力工具。最近,中山大學等聯合國內數家單位,借助上海國家生物工程中心的伯豪生物芯片有限責任公司平臺,完成全基因組DNA甲基化高通量芯片檢測,篩選出三個與肝癌復發的基因,這些基因能在多中心大樣本良好的區分復發和未復發病人,相關結果發表在國際臨床腫瘤學頂尖雜志journal of clinical oncolgy。該結果有望為早期肝癌患者提前預警,也為肝癌靶向治療提供潛在作用靶點。

 

案例二:伯豪客戶《Nature Communications》甲基化研究揭示鼻咽癌治療新靶點

研究背景

在中國華南地區,鼻咽癌有較高的發病率。目前,鼻咽癌病人的治療方案主要取決于病人的TNM分期。但是,約30%的鼻咽癌病人雖然處于相同的TNM分期,采用相同的治療方案,其結果也不盡相同。表觀層面的改變對于腫瘤起始和發展,發揮著重要的作用。目前,在鼻咽癌轉移發生過程中表觀的改變并不清楚,也沒有預測模型精確的篩選出高轉移風險的鼻咽癌病人。中山大學附屬腫瘤醫院的科學工作者,采用甲基化芯片在全基因組范圍內鑒定了鼻咽癌病人特異的轉錄因子HOPX。該研究為鼻咽癌診斷提供了新的生物標記,為鼻咽癌的治療提供了新的靶點。

研究結果

1. 鼻咽癌細胞中HOPX啟動子區域高甲基化
研究者通過比較24例正常與24例鼻咽癌組織450K甲基化芯片結果,發現344個轉錄因子的1984個CpG位點甲基化有顯著差異。分級聚類分析后,發現HOPX(cg21899596)在鼻咽癌中甲基化差異最為顯著。隨后,在8例正常與8例鼻咽癌患者中進行了焦磷酸測序驗證。這一結果同樣在鼻咽癌細胞系中得到了進一步證實。

2. 鼻咽癌中HOPX表達下調是由于啟動子區高甲基化
在鼻咽癌組織和細胞系中,通過real-time PCR檢測發現HOPX的表達顯著低于正常組織和細胞。改變HOPX啟動子區甲基化狀態后,HOPX的表達顯著升高。

3. HOPX在體外抑制鼻咽癌細胞系遷移和侵襲
在鼻咽癌細胞系中過表達HOPX后,鼻咽癌細胞的遷移和侵襲被顯著的抑制,而細胞的生長并沒有被影響。

4. HOPX抑制鼻咽癌細胞的EMT過程
在N2-Tert,,NP69 和SH cells敲低HOPX后,細胞形態發生顯著變化。SUNE1細胞系中過表達HOPX后,檢測發現ECADHERIN顯著上調。

5. 鼻咽癌細胞中HOPX抑制SNAIL轉錄
由于EMT-TFs在EMT過程中起著重要的角色,研究者檢測了HOPX表達改變后已知的EMT-TFs調節者(SNAIL,SLUG, ZEB1, ZEB2, TWIST1 和 FOXC2)的變化。HOPX表達量改變后,只有SNAIL有顯著的變化。研究發現,HOPX可以與SNAIL的啟動子區結合。

6. HOPX通過募集HDAC2抑制SNAIL的轉錄
免疫共沉淀研究發現,在生理狀態下HDAC2與HOPX結合。HOPX與HDAC2結合后,更多的HDAC2募集在SNAIL的啟動子區,抑制SNAIL的轉錄。

7. HOPX抑制SNAIL轉錄是SRF依賴的
通過檢測SNAIL結合HOPX的啟動子區序列,發現了一個血清效應因子應答元件SRF。在之前的研究中,發現SRF可以與HOPX結合。在鼻咽癌細胞系CNE2和SUNE1細胞系中,過表達SRF顯著提高了SNAIL轉錄并降低了ECADHERIN的轉錄。CoIP實驗驗證了在生理狀態下HOPX與SRF的結合。HOPX在SRE突變的體系中,并不能影響SNAIL的轉錄。HOPX與SRF共表達的情況下,能夠顯著抑制SNAIL的轉錄。因此,HOPX通過募集HDAC2抑制SRF依賴的SNAIL轉錄。

8. 恢復SNAIL的表達能夠抵消HOPX對鼻咽癌細胞遷移和侵襲的抑制
在鼻咽癌細胞中過表達SNAIL后,顯著的削弱了HOPX對鼻咽癌細胞的遷移和侵襲的抑制,而且ECADHERIN的表達降低,VIMENTIN的表達升高。

9. 在活體動物體內HOPX抑制鼻咽癌細胞的惡性進程
在小鼠腹股溝淋巴結轉移模型內,過表達HOPX抑制鼻咽癌細胞的轉移。免疫組化結果也證實在動物體內和臨床組織內,HOPX抑制SNAIL的表達,進而抑制鼻咽癌的惡性進程。

10. HOPX增加鼻咽癌細胞對順鉑的敏感性
在小鼠移植瘤模型內,HOPX過表達顯著提高了順鉑對腫瘤的抑制作用。

11. HOPX的甲基化程度與鼻咽癌病人的生存率密切相關
為了檢測HOPX的甲基化是否與鼻咽癌病人的臨床生存率相關,研究者采用焦磷酸測序檢測了443例鼻咽癌病人的組織。在訓練組中72.5%(185/255)HOPX高甲基化。在驗證組中,59%的鼻咽癌病人HOPX高甲基化并伴隨著較短的生存期。

研究結論

鼻咽癌病人中HOPX啟動子區高甲基化導致的其表達量降低,促進了鼻咽癌細胞的遷移和侵襲。這一生物學進程是由于HOPX在生物體內與HDAC2結合,能夠抑制SRF依賴的SNAIL的轉錄。HOPX的甲基化程度與臨床鼻咽癌病人的生存率高度相關。這一研究結果為鼻咽癌病人的惡性診斷提供了重要依據,豐富了鼻咽癌的治療靶點。

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