技術服務熱線:800-820-5086 | 400-880-5086 登錄 | 注冊 ENGLISH

表觀組-全基因組Bisulfite甲基化測序(WGBS)

全基因組甲基化測序(WGBS)介紹

全基因組甲基化測序(WGBS,Whole-genome bisulfite sequencing)結合了亞硫酸氫鹽轉化方法與新一代高通量測序技術,可在單堿基分辨率水平上高效地檢測全基因組DNA甲基化狀態。亞硫酸氫鹽處理可以使DNA中未發生甲基化的胞嘧啶脫氨基轉變成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不變,PCR擴增所需片段,則尿嘧啶全部轉化成胸腺嘧啶。對 PCR產物進行高通量測序,與參考序列比對,即可判斷CpG/CHG/CHH位點是否發生甲基化。

 

伯豪特色

建庫質量高,失敗率極低,每年五萬例左右各種類型樣本文庫構建經驗。
質控過程全程可溯,實時跟蹤,反饋及時,確保數據真實可靠。
基礎分析豐富,展示形式可個性化定制。
高級分析服務:專業的生物信息分析團隊,熟悉各種分析算法和軟件;根據客戶的需求,提供多種個性化的實現方案。


實驗流程 


分析流程


 

推薦測序模式

  1. Hiseq X Ten, PE150
  2. 至少30 X基因組大小

分析內容

測序數據質量控制
包括:總reads數、總base數,Q20比例、Q20位點分布圖、堿基分布圖。
測序數據預處理
包括:去除總體質量偏低的reads,將質量大于20堿基所占比例小于50%的reads去除;去除3’端質量Q低于20的堿基;去除reads中所含有的接頭序列;去除長度小于20的測序片段(reads),去除含有低質量N堿基的reads。
轉化效率評估
使用lamda噬菌體基因組作為內參,評價BS轉化效率。
全基因組比對和mapping率統計。
CpG島區域、啟動子區域及整個基因組的覆蓋及不同深度關系。
CpG/CHG/CHH位點覆蓋率、測序深度、甲基化比例和染色體分布。
差異甲基化位點和區段篩選。
基因promoter、TSS、gene body區域甲基化水平計算和篩選。
差異甲基化位點或區段的CpG島注釋和基因注釋。
全基因組甲基化圖譜。


結果展示



樣本要求

  1. 樣品純度:OD 260/280值應在1.8~2.0 之間; RNA 應去除干凈;
  2. 樣品濃度:低濃度不低于50ng/μl;
  3. 樣品總量:每個樣品總量不少于2μg;
  4. 樣品溶劑:應溶解在H20或TE (pH 8.0)中;
  5. 樣品運輸:DNA低溫運輸(-20℃);在運輸過程中用parafilm將管口密封好,以防出現污染。

 

常見問題

1.哪些物種可以研究WGBS?

要做全基因組甲基化分析,對物種有以下要求:
a. 物種為真核生物;
b. 物種具有參考基因組,至少拼接到scaffold水平;
c. 具有較為完整的注釋。

 

2.全基因組甲基化測序有哪些優勢?

在全基因組水平,單堿基分辨率檢出甲基化位點,不僅能夠高精度發現CpG島等常見區域的甲基化水平的變化,還能夠分析gene body區,基因間區等區域的甲基化水平的差異,分析甲基化對染色體的狀態以及基因結構變化的影響,從多維度分析解決生物學問題。

 

3.為什么WGBS所得的raw data產量和Q30比例較全基因組重測序的低?

因為在WGBS建庫過程中,非甲基化的C會轉化為U(測序過程中呈現為T),因此WGBS文庫處于堿基極度不平衡的狀態(read1中C含量極低、read2中G含量極低)。而Illumina測序儀在cluster定位過程中會過濾較高比例的cluster,使得raw data產量降低;另外由于GC含量較極端,測序過程中質量值也較容易下降。

 

案例展示

人類早期胚胎DNA甲基化圖譜

在哺乳動物胚胎的早期發育中,甲基化是表觀調節的重要內容。但是,在人類全基因組范圍內,胚胎的早期甲基化動態調節模式由于技術的困難和材料的缺乏并沒有充分的研究分析。本研究中,通過全基因組的亞硫酸氫鹽測序技術,系統的描繪了從受精卵到胚胎植入后甲基化的變化。研究發現,在2細胞時期全基因組發生了去甲基化波動。這與之前在小鼠中的研究結果相反。而且,來自父本染色體上的基因去甲基化顯著快于母本,到受精卵時期結束的時候父本的前核甲基化狀態已經低于母本的前核。在早期胚胎發育的過程中,啟動子區甲基化與基因表達的負相關性逐漸加強,在胚胎移植后到達峰值。此外,本研究還指出活躍的基因在胚胎移植前的整個過程都沒有被甲基化。早期胚胎往往保持更高的甲基化殘留,在轉座子進化上更活躍。這些研究對于研究人類早期胚胎的甲基化提供了新的視角。