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表觀組-焦磷酸測序

焦磷酸測序介紹

焦磷酸測序技術(pyrosequencing)是由DNA 聚合酶(DNA polymerase)、ATP 硫酸化酶(ATP sulfurytase)、熒光素酶(1uciferase)和三磷酸腺苷雙磷酸酶(Apyrase) 這4種酶催化的同一反應體系中的酶級聯化學發光反應。它是單個或多個特定甲基化位點定量檢測的金標準,是高通量甲基化測序和芯片較為理想的驗證方法,另外,焦磷酸測序還可以定性檢測SNP。

 

技術原理

  1. 在每一輪測序反應中,待測樣本的反應體系中只加入一種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP);
  2. 互補的堿基結合在模板上時,會釋放出一個焦磷酸基團Pyrophosphate (PPi);
  3. 在ATP 硫酸化酶的作用下,生成的PPi 可以和APS 結合形成ATP;
  4. 在熒光素酶的催化下,生成的ATP 又可以和熒光素結合形成氧化熒光素,同時產生可見光;
  5. 光信號被CCD數碼相機捕捉,經過軟件處理后,獲得一個特異的檢測峰;
  6. 反應體系中剩余的dNTP 和殘留的少量ATP 在Apyrase 的作用下發生降解;
  7. 待上一輪反應完成后,加入另一種dNTP,使上述反應重復進行。

 

服務流程

  1. 方案確定與專業的引物設計評估
  2. 合同簽訂與送樣
  3. 樣本抽提質檢
  4. 引物合成與預實驗
  5. 亞硫酸鹽轉化與純化
  6. PCR擴增與純化(有一端引物帶有生物素標記,擴增出包含測序序列的區域,擴增后用鏈霉親和素磁珠純化。)
  7. 焦磷酸測序
  8. 數據分析

 

樣品要求

  1. 濃度>25ng/μl,總量>500ng(起始量根據每個樣本要做的反應數可適當調整);
  2. OD260/280=1.6-2.0,OD260/230>1.5;
  3. 電泳主帶清晰,無明顯降解;
  4. 無蛋白和RNA污染;
  5. 特殊樣本,如FFPE等,可以降低條件,但是有風險。

 

儀器平臺

  • Qiagen PyroMark Q96 ID實時定量焦磷酸序列分析儀

 

應用案例

焦磷酸測序檢測宮頸癌中UTF1啟動子區域甲基化水平

研究者利用Illumina Human Methylation27芯片對9例樣本(4例正常,5例宮頸癌)進行全基因組啟動子區甲基化掃描,結果顯示宮頸癌患者UTF1啟動子區域呈現出高的甲基化狀態。為了驗證芯片篩選的結果,采用焦磷酸測序方法首先對這些樣本的UTF1啟動子區域進行深入分析,結果表明正常宮頸中UTF1啟動子區域呈現低甲基化狀態,而相同的位點在SCC中呈現高甲基化狀態。為了進一步驗證,研究者擴大樣本量,對47例不同類型的石蠟包埋組織樣本及10例白細胞進行焦磷酸測序檢測,與之前的結論保持一致。結合RNA水平和蛋白水平的實驗,研究者后提出UTF1啟動子甲基化狀態可以作為宮頸癌診斷的一個重要的分子標志物。

原文:Aberrant Promoter Methylation and Expression of UTF1 during Cervical Carcinogenesi. Plos One. 2012 ,7(8):e42704.


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