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宏基因組-微生物16S/18S/ITS等擴增子測序

微生物16S/18S/ITS等擴增子測序簡介

16S rDNA 擴增子測序:16S rDNA為原核生物中編碼核糖體小亞基rRNA的DNA序列,具有9個高變區域(V1-V9)和10個保守區域,其中保守區反映細菌種屬間親緣關系,高變區反映了物種間的特異性,選擇通用引物進行PCR擴增,進而通過新一代測序技術對16S rDNA的單個或多個高變區進行測序,來分析環境或者臨床樣本中古菌或細菌的群落結構多樣性。 18S rDNA擴增子測序:18S rDNA真核生物中編碼核糖體小亞基rRNA的DNA序列,具有可變區(V1-V9,沒有V6區)和保守區。保守區反映生物物種間的親緣關系,高變區反映物種間的差異。選擇通用引物進行PCR擴增,進而通過新一代測序技術對18S rDNA的高變區(一般選擇V4區)進行測序,來分析環境或者臨床樣本中真核生物群落結構多樣性。 ITS擴增子測序:ITS分為兩個區域:ITS1/ITS2,其中ITS1位于真核生物核糖體rDNA序列18S和5.8S之間,ITS2位于真核生物核糖體rDNA序列5.8S和28S之間。通過新一代測序技術對ITS1或者ITS2進行測序,進一步做環境微生物中真菌多樣性分析。

 

伯豪特色

  1. 先進的測序平臺:Illumina PE250/300 高通量測序平臺可供選擇,根據檢測目的提供不同的解決方案;
  2. 項目經驗豐富:可提供腸道、水體、土壤、組織液等多種樣本類型的微生物多樣性與環境、農林及醫療等多領域的分析服務;
  3. 專業全面的服務:經驗豐富的技術團隊可提供專業的方案設計、檢測報告解讀、文章寫作建議等;
  4. 個性化服務:針對VIP客戶的個性化分析需求,提供專業全面的檢測服務。提供專業的實驗指導和定制高級分析。

 

實驗流程

 

分析流程

 

方案策略

 

測序平臺

Miseq

 

樣本要求

環境及臨床樣本(干冰或冰袋運送)

  1. 土壤≥ 3 g(污染土壤樣本要適當增加送樣量);糞便≥ 2 g;
  2. 水體樣本:濾膜(0.22 μm濾膜) ≥ 2個;拭子樣本≥ 2個;

DNA/PCR產物(干冰或冰袋運送)

  1. DNA:濃度≥ 20 ng/μL;總量≥ 400 ng;DNA要有明顯主帶,無降解;OD260/280= 1.8-2.0
  2. PCR 產物:濃度≥ 20 ng/μL,總量≥ 400 ng,片段大小< 450 bp,條帶單一,無降解,無引物二聚體

 

部分類似結果展示

 

案例解析

案例一:乙酸鹽有利于好氧顆粒污泥對發酵液中磷的富集
微生物的厭氧消化(Anaerobic digestion,AD)是一種有效的,而且被廣泛運用在能源和資源恢復中的生物技術。厭氧消化產生的污水以及發酵產生的發酵液中含有許多的對環境有害的有機質物質,比如易揮發的脂肪酸和礦物質元素(氮和磷),由于這些有機質物質不能被很好的處理,進而對我們的環境造成了嚴重的污染。本研究通過使用兩個相同批次的反應器Ra和Rp,分別使用乙酸和丙酸作為額外添加碳源,來培養好氧顆粒進而去除發酵液中的磷。同時,作者通過二代測序的方法對兩個反應器中的微生物多樣性進行檢測。結果顯示,Ra反應器中的好氧顆粒具有較高的磷去除能力。微生物多樣性檢測結果發現,Ra反應器中擬桿菌(34%)和beta變形菌門的含量較多,推測擬桿菌(34%)和beta變形菌門可能是造成高效去除磷能力的主要原因。

原文出處:Cai W, Huang W, Li H, et al. Acetate favors more phosphorus accumulation into aerobic granular sludge than propionate during the treatment of synthetic fermentation liquor. Bioresource technology, 2016, 214: 596-603. IF= 4.494.

 

案例二:腸芽囊原蟲可以增加人類腸道細菌微生物的多樣性
本文通過二代測序平臺Ion Torrent對48個腸道定植有牙囊原蟲的病人的糞便樣本以及48個正常人的糞便樣本進行16S rDNA的V3-V5區進行測序,結果表明定植有牙囊原蟲的病人的腸道細菌多樣性比健康人的豐富,其中梭狀芽胞桿菌比較豐富,而腸桿菌相對要少。這個結果表明,腸道中定植有牙囊原蟲可以營造一個健康的腸道微生物多樣性,而不會造成腸道微生物多樣性的失衡。

原文出處:Audebert C, Even G, Cian A, et al. Colonization with the enteric protozoa Blastocystis is associated with increased diversity of human gut bacterial microbiota. Scientific reports, 2016, 6. IF= 5.578.

 

案例三:產道液體擦拭嬰兒身體可以部分恢復剖腹產嬰兒的微生物多樣性
剖腹產嬰兒從母體獲得微生物的種類與自然分娩嬰兒從母體獲得的微生物的種類有很大的差別,這些微生物種類的差異回來代謝紊亂和免疫紊亂的風險,因此如何避免剖腹產造成的嬰兒微生物種類變化變得十分重要,本研究用母體產道液體來對剖腹產嬰兒進行擦拭,30天后通過16S rDNA測序技術對剖腹產嬰兒的皮膚,口腔和腸道進行微生物的多樣性檢測,發現用產道液體擦拭的剖腹產嬰兒的微生物多樣性與自然分娩嬰兒的微生物多樣性相似。同時也證明了,剖腹產嬰兒腸道,皮膚和口腔微生物只能部分通過從母體獲得。

原文出處:Dominguez-Bello M G, De Jesus-Laboy K M, Shen N, et al. Partial restoration of the microbiota of cesarean-born infants via vaginal microbial transfer. Nature medicine, 2016. IF= 27.363.

 

常見問題

1、一個OTU(Operational Taxonomic Units)就是一個物種嗎?OTU是指在群體研究中為了便于分析,人為給定的一個分類單元,理論上一個OTU代表一個物種,也有可能幾個OTU都注釋到同樣的物種。

 

2、微生物組學研究中生物學重復設置幾個比較合適呢?為了保證研究結果的可靠性,需要設置生物學重復。一般類型的樣本(土壤,水體等)需要3個以上生物學重復;臨床樣本(拭子,糞便,唾液等)通常需要10個以上甚至幾百個生物學重復;模式動物樣本(小鼠,大鼠等)需要8個以上。為了保證理想的實驗結果,建議老師在經費允許的情況下,盡可能的選擇更多的樣本來進行實驗。

 

3、環境微生物多樣性測序可以鑒定到物種的種水平嗎?
分析結果中物種的注釋結果取決于數據庫中的注釋,一般16S rDNA擴增子測序可以分類到屬水平,現有的文章中也大多會討論到屬水平。這主要因為16S rDNA序列在某些物種間的差別非常非常小,同時測序本身也存在一定的錯誤率,如果強行分類到種水平,會浪費很多reads,鑒定的結果可靠性也會降低,不能客觀反映樣本本來的微生物組成情況。而宏基因組測序可以通過比對marker進行的方式將物種鑒定到種甚至菌株的水平。

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